Kantserogeneesi uurimine ja hindamine

Kartsinogeneesi uuritakse erinevate standardiseeritud toksikoloogiliste testidega. Nende testide esimene osa viiakse läbi in vitro ja kui need on positiivsed, jätkame in vivo katsetamist. Seda eksperimentaalset samm-sammult lähenemisviisi nimetatakse OTSUSPISTE LÄHENEMISEKS, katsete jada, mis peatub iga katse lõpus, et otsustada, kuidas katsega edasi minna. On viis etappi:

ETAPP: kantserogeense ühendi struktuur ja omadused;

PHASEB: selles lühiajalise in vitro katsetamise faasis kasutatakse imetajarakke. Kõige sagedamini kasutatavad rakud on hepatotsüüdid, sest uuritakse hepatotsüütide tekitatud kahjustuste parandamise ulatust vastavalt aine põhjustatud kahjustuse tõsidusele. Lühidalt, me ei määra kahjustusi iseenesest, vaid seda, kui palju parandussüsteemi on aktiveerinud maksarakk.

Rakendatud protseduur on 3 hepatotsüütide kultuuri moodustamine. Esimeses kultuuris on hepatotsüüdid terved, teises töödeldakse neid uuritava ainega ja lõpuks kolmandas kontroll -ainega, mis on kindlasti kantserogeenne.Need kolm kultuuri sisaldavad radioaktiivset pürimidiinalust, mis on tritiseeritud tümidiin, mis toimib markerina.

Kui uuritav ühend põhjustab DNA mutatsiooni, reageerib rakk sellele probleemile, aktiveerides parandussüsteemid. Mutatsiooni läbinud DNA tükk lõigatakse läbi ja tänu DNA polümeraasi toimele asendatakse puuduv tükk uuega. Parandamiseks kasutab DNA polümeraas uusi aluseid, sealhulgas tritiseeritud tümidiini. Lisatakse radioaktiivne alus. Radioaktiivsuse analüüs määrab kindlaks mutatsiooni taseme töödeldud rakkudes: mida suurem on radioaktiivsus, seda suuremad on DNA mutatsioonid.

Samuti viiakse B -faasis läbi ka bakterite testid, et uurida, kas esineb pöördmutatsioone. Kasutatavad bakterid on salmonellad, mis on juba mutatsioonide kandjad. Mutatsioon puudutab histidiini sünteesi, nii et salmonellad ei saa ilma histidiinita kasvada. Neid bakterikolooniaid võetakse osaliselt uuritava ainega töötlemiseks, osaliselt negatiivse kontrolli ja osaliselt positiivse kontrolli jaoks, seejärel testitakse teadaoleva kantserogeeniga. Kui see uuritav aine on kaudne genotoksiline, tuleb söötmesse sisestada metaboliseerivaid ensüüme. Sel hetkel külvatakse ja kasvatatakse 3 kultuuri Petri tassides (kultuurisöötmes ei ole histidiini). Kui testitavat kantserogeeni mutatsioone pole esinenud, siis teoreetiliselt ei tohiks neid plaatidel olla . Kui kantserogeenil oli mutageenne toime, võis see muuta esimest mutatsiooni ja luua teise mutatsiooni, mis on võimeline baktereid histidiinivabal söötmel kasvatama. Sel juhul teine mutatsioon, mis muudab esimest mutatsiooni ja kannab nime RETROMUTATION Lõpuks, kui piasta petris toimub märkimisväärne kasv, on kantserogeen otsene.
Alati in vitro testiga on võimalik kindlaks teha kromosomaalne terviklikkus. Seda testi tehakse alati imetajarakkudega ja seda kasutatakse toksiliste ainete testimiseks, mis võivad põhjustada mutatsioone mõnel DNA biosünteesi eest vastutaval ensüümil. Katsetatav aine viiakse läbi in vitro analüüsiks Et teha kindlaks, kas uuritav aine mõjutab olemasolevate kromosoomide terviklikkust ja arvu, kasutatakse mikrotuumade testi. Mikrotuumad on vesiikulid, mis moodustuvad kromatiini osa sees. Nendesse mikrotuumadesse lisatud kromatiin võib olla kas terved kromosoomid või kromosoomide fragmendid. Mikrotuumad on moodustatud vale rakkude jagunemise tõttu, mille tulemuseks on tütarrakud, mille geneetiline materjal ei ole võrdne Selle katse tulemusel määratakse kindlaks klasstogeenseteks ja spindlimürkideks määratud ained. Klastogeenne aine toodab mikrotuumasid koos kromosoomide akentriliste fragmentidega, nii et aine kutsub esile kromosoomide purunemise, selle asemel tekitab spindli mürgine aine selle sees olevad mikrotuumad on terved kromosoomid.
Kui uuritav aine põhjustab ühes või mitmes katses genotoksilisust, on see määratletud kui väga kahtlane, seega läheb see otse faasi D. Kui teisest küljest ei avalda testitav aine genotoksilist toimet, läheb see edasi uurimisfaasi C, sest see võib olla promootor.

FASEC: selles faasis saab teha nii in vitro kui ka in vivo katseid.

In vitro katsete puhul oli võimalik tõestada, et promootoraine võib murda normaalsete rakkude ja kasvajarakkude vahelisi lõhesid, mille tagajärjeks on ainete liikumine kahe raku vahele.

In vivo test on naha kasvajate esilekutsumine hiirtel. Testitavat ainet kantakse kaks või kolm korda nädalas hiire nahale. Kui see aine on promootor, võib 2/3 kuu jooksul tekkida papilloomimoodustisi. Hiirtel võetakse arvesse kahte peamist teavet: papilloomidest mõjutatud hiirte arv ja igal loomal esinevate papilloomide arv. Kui aine toimib promootorina ja arendab ravitud hiirel kasvajat, tähendab see, et see on tõepoolest promootori toimega aine.

Kui need testid on lõpule viidud, läheme edasi pikaajaliste in vivo testide juurde.

TÕHUS: selles faasis testitakse kõiki ühendeid, mis osutuvad mutageenseteks, ja kõiki ühendeid, mis ei ole mutageensed. Testid, mida saab teha, on erinevad, mõned neist on maksa-, kopsu- ja lõpuks rinnauuringud.

Maksa test näitab mitte äsja moodustunud kasvaja, vaid neoplastilise fookuse moodustumist, seega midagi, mis valmistub kasvajaks. Selle fookuse rakud on juba ebatüüpilised rakud, seetõttu on nad läbi teinud mutatsiooni ja valmistuvad muutuma neoplastilisteks rakkudeks. Teatud aja möödudes, tänu lahanguuuringule, määratakse neoplastiliste fookuste teke, arvutades nende neoplastiliste moodustiste arvu ja ulatuse.

Kopsutest võimaldab määrata adenoomi, mis on "kopsukoe rakkude anomaalia. Ka sel juhul uuritakse roti kopsukoe üsna pika aja (kuude) pärast (need adenoomid on kergesti tuvastatavad, kuna on valkjad sõlmed kopsuepiteelil).
Rinnakatse võimaldab määrata kasvajaid näärmekoes. Alati hinnatakse moodustunud adenoomide ja adenoomidega loomade arvu.

Kui nende testide tulemused on positiivsed, on uuritav aine tõepoolest kantserogeen. Siinkohal liigume edasi kulukate testide läbiviimiseks, mille täitmisaeg on väga pikk.

FAAS: selles faasis tehakse pikaajalisi katseid muutuvale arvule loomadele, 20 kuni 50. Need testid on väga kallid ja teatud tulemuste saamiseks kulub palju aega; me räägime umbes 1/8 looma elust.Võimalik, et nende testide käigus mõned loomad surevad, kuid neid uuritakse alati lahkamise ja histoloogilise tüübiuuringuga. Valitud loomad on alati rotid ja hiired ning ainult 70–80% jäävad ellu pikaajaliste testide lõpuni. Kasutatavad loomad on lihtsalt võõrutatud, sest mida nooremad nad on, seda tundlikumad nad on ravi suhtes. Pikaajalise katseperioodi jooksul toetab teadlast alati matemaatik-statistik, kes on võimeline kogu kogutud teavet arvesse võtma ja erinevaid andmeid taasesitama.

Loomadel testitud doosid algavad maksimaalsest talutavast annusest ja selle kõikidest osadest ning hinnatakse looma annuse-reaktsiooni reaktsiooni.
Manustamisel tuleb alati läheneda teele, mille kaudu mees võib uuritava ainega kokku puutuda, seega suu, naha või hingamisteed, samas kui ravimi kantserogeensuse testimisel on kasulik ka intravenoosne manustamine.
Testitud loomarühmi on 4 (50 looma iga rühma kohta):

NAIF -i rühm, kellel puudub ravi;
Sõidukiga töödeldud rühm;
Uuritava ainega töödeldud rühm;
Rühm, keda raviti teadaoleva kantserogeeniga.

On väga oluline, et loomade arv igas rühmas oleks võimalikult võrdne.Tegelikult, kui loomade arv on liiga suur, võib statistiline test osutuda võltsiks.
Läbiviidavad hindamised on järgmised:

Kasvajate kogu sagedus;
Mõnede kasvajate esinemissagedus;
Enam kui ühte tüüpi kasvajatega loomade esinemissagedus;
Loomade vähkkasvajate arv.

Kõigi nende uuringuetappide lõpus klassifitseeritakse aine IARC (Rahvusvaheline Vähiuuringute ja Arendusagentuur) ja Keskkonnakaitseagentuuri (EPA) poolt koostatud edetabelisse.